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本試劑盒針對(duì)偽狂犬病毒GE基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用經(jīng)典方法提取DNA，并以之為模板，在Taq聚合酶作用下，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片段，使目的基因增加百萬(wàn)倍，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬偽狂犬病毒野毒株的快速鑒別診斷。
【試劑盒組份】
1、試劑盒組成及貯藏條件

名稱	20份	貯藏條件
1、0.2 mL PCR管	25個(gè)	冷藏 (A盒)
2、消化液	4ml
3、結(jié)合液	6ml
4、吸附柱	20個(gè)
5、收集管	20個(gè)
6、洗液	2*10ml
7、洗脫液	500μL
8、TAE緩沖液（50×）	20ml
9、陽(yáng)性對(duì)照	50μL	-20℃ (B盒)
10、陰性對(duì)照	50μL
11、PCR反應(yīng)液	350μL
12、蛋白酶K	220μL

2、有效期：6個(gè)月。
    3、需自備材料：生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無(wú)菌注射器、無(wú)菌1.5mL離心管和吸頭、瓊脂糖、DL2000、染色液。
【操作步驟】
    一、樣品制備
1、拭子樣品：用棉拭子沾取動(dòng)物鼻腔、乳汁、精液、陰道分泌物等置生理鹽水中攪拌，低溫保存送檢；
2、組織樣品：采集流產(chǎn)胎兒、腦、扁桃體、肺等組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加少量生理鹽水混勻，4℃條件下8000rpm，離心1min，取上清于滅菌的離心管中待檢。
    3、樣本要求：采樣量要足夠進(jìn)行一次復(fù)檢，運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程確保低溫，盡量避免反復(fù)凍融，檢測(cè)前需充分解凍。
    二、DNA的提取
    1、向無(wú)菌的1.5ml EP管中分別加入樣品液100μL、消化液 200μL（用前37℃溫育使之充分溶解），蛋白酶K 10μL充分混勻，56℃水浴30～60min；
    2、取出樣品管，降到室溫，分別加入結(jié)合液300μL，混勻，將全部液體加入套有收集管的吸附柱中（注意勿吸到雜質(zhì)，以免堵塞柱子），12000rpm，離心1min；
    3、棄收集管液體，向吸附柱中加500μL DNA洗滌液，4℃條件下12000rpm，離心1 min；
    4、重復(fù)步驟3；
5、棄收集管液體，瞬離以徹底去除殘留液體；
6、將吸附柱轉(zhuǎn)入新的EP管中，柱中央滴加20 μL洗脫液，靜置2min，4℃條件下12000rpm，離心2 min，EP管中液體即為DNA溶液；
    三、PCR擴(kuò)增
    1、配液：取出PCR反應(yīng)液,在室溫融化后，瞬離，按15μL/管分裝到PCR反應(yīng)管中；
    2、加樣擴(kuò)增：分別向PCR管中加入5μL樣本DNA或陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照，在PCR儀上運(yùn)行以下程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。
    四、電泳鑒定
    1、制膠：用50倍TAE電泳緩沖液稀釋到1倍后配制適量1.0%瓊脂糖凝膠；
    2、電泳：直接取5μL～10μL RT-PCR產(chǎn)物或DL2000直接點(diǎn)樣于凝膠孔中，以5 V／cm電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳；
    3、染色、觀察：將電泳好的凝膠放在加有染色液的1倍TAE緩沖液中浸泡數(shù)分鐘，取出（小心污染）在紫外燈下觀察結(jié)果，進(jìn)行判定并做好檢測(cè)記錄。
【結(jié)果判定】
1、成立條件：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)379 bp條帶,陰性對(duì)照無(wú)目的帶時(shí),試驗(yàn)結(jié)果成立；
2、結(jié)果判定：被檢樣品出現(xiàn)379 bp條帶為豬偽狂犬病毒野毒株陽(yáng)性；否則為陰性。
【注意事項(xiàng)】
    1、實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按操作步驟執(zhí)行；不使用本試劑盒提供的組分或不按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。
    2、實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)人員須為專業(yè)人員，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備；各區(qū)間人員流動(dòng)及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求；實(shí)驗(yàn)用消耗品應(yīng)有合理的清潔和質(zhì)檢程序，避免環(huán)境或物品污染PCR殘留產(chǎn)物導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，避免核酸酶污染或擴(kuò)增反應(yīng)抑制物造成假陰性結(jié)果。
    3、所有病料相關(guān)容器應(yīng)盡量潔凈、無(wú)菌、低溫條件保存；完成樣本核酸提取后，建議馬上進(jìn)行下一步試驗(yàn)，短期可保存于-20℃，長(zhǎng)期應(yīng)保存在-70℃。
    4、操作臺(tái)、移液器、離心機(jī)、耗材等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實(shí)驗(yàn)房間、超凈工作臺(tái)應(yīng)定期或每次實(shí)驗(yàn)后用紫外燈處理。
    5、所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存，凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒，應(yīng)于室溫下避光保存，操作時(shí)應(yīng)戴上手套，相應(yīng)操作結(jié)束后手套要處理掉，不能再接觸其它任何物品，以減少污染區(qū)。
    7、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    8、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物等應(yīng)及時(shí)收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行無(wú)害化處理。

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