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【檢測原理】
本試劑盒采用柱式法提取RNA，針對HP-PRRSV基因組非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2編碼區(qū)缺失30個氨基酸的特性設(shè)計(jì)特異性引物，采用一步法RT-PCR進(jìn)行反轉(zhuǎn)擴(kuò)增，使目的基因擴(kuò)增百萬倍，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察判定，實(shí)現(xiàn)對高致病性藍(lán)耳病病毒毒株的快速檢測。
【試劑盒組份】
1、試劑盒組成及貯藏條件

名稱	20份	貯藏條件
1、0.2 mL PCR管	25個	冷藏 (A盒)
2、吸附柱	20個
3、收集管	20個
4、裂解液	10 ml
5、洗液	2*10ml
6、洗脫液	500μL
7、TAE緩沖液（50×）	20ml
8、陽性對照	50μL	-20℃ (B盒)
9、陰性對照	50μL
10、RT-PCR反應(yīng)液A	120μL
11、RT-PCR反應(yīng)液B	240μL

2、有效期：6個月。
    3、需自備材料：生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無菌注射器、無RNA酶1.5ml EP管和吸頭、瓊脂糖、DL2000、染色液。
【操作步驟】
    一、樣品制備
1、拭子樣品：用棉拭子沾取動物精液、糞便等,置于生理鹽水中攪拌,低溫保存送檢；
2、組織樣品：采集有明顯病變的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟或胎兒等組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加少量生理鹽水混勻，4℃條件下8000rpm，離心1min，取上清于滅菌的離心管中待檢。
    3、樣本要求：采樣量要足夠進(jìn)行一次復(fù)檢，運(yùn)輸、儲存過程確保低溫，盡量避免反復(fù)凍融，檢測前需充分解凍。
    二、病毒RNA的提取
    1、向無RNA酶的1.5ml EP管中分別加入樣品液200μL、裂解液 500μL，顛倒混勻，靜置2～3min；
    2、將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中（取上清液避免堵塞柱子）,12000rpm離心1min；
    3、棄收集管液體，向吸附柱中加500μL洗液，12000rpm離心1min；
    4、重復(fù)步驟3；
    5、棄收集管液體，瞬離以徹底去除殘留液體；
    6、吸附柱轉(zhuǎn)入新的無酶EP管中，柱中央滴加20μL洗脫液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，EP管中液體即為RNA溶液；
    三、RT-PCR
    1、配液：取出RT-PCR反應(yīng)液,在室溫融化后，瞬離，按照每份RT-PCR反應(yīng)液A液5μL，RT-PCR反應(yīng)液B液10μL的比例預(yù)混兩種反應(yīng)液,按15μL/管分裝到PCR反應(yīng)管中；
    2、加樣RT-PCR：分別向PCR管中加入5μL樣本RNA或陰性對照或陽性對照，在PCR儀上運(yùn)行以下程序：42℃ 30 min，94℃ 5 min；94℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。
    四、電泳鑒定
    1、制膠：用50倍TAE電泳緩沖液稀釋到1倍后配制適量1.0%瓊脂糖凝膠；
    2、電泳：取5 μL～10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物或DL2000直接點(diǎn)樣，以5 V／cm電壓于1倍TAE緩沖液中電泳；
    3、染色、觀察：將電泳好的凝膠放在加有染色液的1倍TAE緩沖液中浸泡數(shù)分鐘，取出（小心污染）在紫外燈下觀察結(jié)果，進(jìn)行判定并做好檢測記錄。
【結(jié)果判定】
    1、成立條件：陽性對照出現(xiàn)400bp 條帶,陰性對照無目的帶時,試驗(yàn)結(jié)果成立；
    2、結(jié)果判定：被檢樣品出現(xiàn)400bp條帶為豬繁殖與呼吸綜合征高致病性毒株陽性；否則為陰性。
【注意事項(xiàng)】
    1、實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按操作步驟執(zhí)行；不使用本試劑盒提供的組分或不按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
    2、實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)人員須為專業(yè)人員，實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，每個階段使用專用的儀器和設(shè)備；各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求；實(shí)驗(yàn)用消耗品應(yīng)有合理的清潔和質(zhì)檢程序，避免環(huán)境或物品污染PCR殘留產(chǎn)物導(dǎo)致假陽性結(jié)果，避免核酸酶污染或擴(kuò)增反應(yīng)抑制物造成假陰性結(jié)果。
    3、所有病料相關(guān)容器應(yīng)盡量潔凈、無菌、低溫條件保存；完成樣本核酸提取后，建議馬上進(jìn)行下一步試驗(yàn)，短期可保存于-20℃，長期應(yīng)保存在-70℃。
    4、操作臺、移液器、離心機(jī)、耗材等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實(shí)驗(yàn)房間、超凈工作臺應(yīng)定期或每次實(shí)驗(yàn)后用紫外燈處理。
    5、所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，使用后立即放回-20℃。
    6、染色液有毒，應(yīng)于室溫下避光保存，操作時應(yīng)戴上手套，相應(yīng)操作結(jié)束后手套要處理掉，不能再接觸其它任何物品，以減少污染區(qū)。
    7、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    8、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物等應(yīng)及時收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行無害化處理。

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