400-150-1718
禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒
產(chǎn)品價格電議400 150 1718
電話：18638666170 - 王曉峰
禽流感病毒H5亞型RT-PCR檢測試劑盒-產(chǎn)品詳情
【檢測原理】
本試劑盒采用柱式法提取樣品RNA，并針對禽流感病毒H5亞型血球凝集素基因的高度保守序列，設(shè)計特異性引物，通過一步法RT-PCR反轉(zhuǎn)擴增靶序列,使目的基因擴大百萬倍，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下對條帶觀察判定，實現(xiàn)對H5亞型禽流感病毒的快速檢測。
【試劑盒組份】
1、試劑盒組成及貯藏條件
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名稱
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20份
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貯藏條件
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1、0.2 mL PCR管
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25個
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冷藏
(A盒)
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2、吸附柱
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20個
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3、收集管
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20個
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4、裂解液
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10 ml
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5、洗液
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2*10ml
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6、洗脫液
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500μL
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7、TAE緩沖液（50×）
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20ml
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8、陽性對照
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50μL
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-20℃
(B盒)
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9、陰性對照
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50μL
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10、RT-PCR反應(yīng)液A
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120μL
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11、RT-PCR反應(yīng)液B
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240μL
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2、有效期：6個月。
3、需自備材料：生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無菌注射器、無RNA酶1.5ml EP管和吸頭、瓊脂糖、DL2000、染色液。
【操作步驟】
一、樣品制備
1、拭子樣品：用棉拭子沾取禽類動物呼吸道分泌物或排泄物等,置于生理鹽水中攪拌,低溫保存送檢；
2、組織樣品：采集有明顯病變的組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加少量生理鹽水混勻，4℃條件下8000rpm，離心1min，取上清于滅菌的離心管中待檢。
3、樣本要求：采樣量要足夠進行一次復(fù)檢，運輸、儲存過程確保低溫，盡量避免反復(fù)凍融，檢測前需充分解凍。
二、病毒RNA的提取
1、向無RNA酶的1.5ml EP管中分別加入樣品液200μL、裂解液 500μL，顛倒混勻，靜置2～3min；
2、將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中（取上清液避免堵塞柱子）,12000rpm離心1min；
3、棄收集管液體，向吸附柱中加500μL洗液，12000rpm離心1min；
4、重復(fù)步驟3；
5、棄收集管液體，瞬離以徹底去除殘留液體；
6、吸附柱轉(zhuǎn)入新的無酶EP管中，柱中央滴加20μL洗脫液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，EP管中液體即為RNA溶液；
三、RT-PCR
1、配液：取出RT-PCR反應(yīng)液,在室溫融化后，瞬離，按照每份RT-PCR反應(yīng)液A液5μL，RT-PCR反應(yīng)液B液10μL的比例預(yù)混兩種反應(yīng)液,按15μL /管分裝到PCR反應(yīng)管中；
2、加樣擴增：分別向PCR管中加入5μL樣本RNA或陰性對照或陽性對照，在PCR儀上運行以下程序：42℃ 30 min，94℃ 3 min；94℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。
四、電泳鑒定
1、制膠：用50倍TAE電泳緩沖液稀釋到1倍后配制適量1.0%瓊脂糖凝膠；
2、電泳：直接取5μL～10μL RT-PCR產(chǎn)物或DL2000直接點樣于凝膠孔中，以5 V／cm電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳；
3、染色、觀察：將電泳好的凝膠放在加有染色液的1倍TAE緩沖液中浸泡數(shù)分鐘，取出（小心污染）在紫外燈下觀察結(jié)果，進行判定并做好檢測記錄。
【結(jié)果判定】
1、成立條件：陽性對照出現(xiàn)380 bp條帶,陰性對照無目的帶時,試驗結(jié)果成立。
2、結(jié)果判定：被檢樣品出現(xiàn)380 bp條帶為H5亞型禽流感病毒陽性；否則判定為陰性。
【注意事項】
1、實驗前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按操作步驟執(zhí)行；不使用本試劑盒提供的組分或不按照說明書進行實驗將可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。
2、實驗室管理應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。實驗人員須為專業(yè)人員，實驗過程應(yīng)分區(qū)進行，每個階段使用專用的儀器和設(shè)備；各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求；實驗用消耗品應(yīng)有合理的清潔和質(zhì)檢程序，避免環(huán)境或物品污染PCR殘留產(chǎn)物導(dǎo)致假陽性結(jié)果，避免核酸酶污染或擴增反應(yīng)抑制物造成假陰性結(jié)果。
3、所有病料相關(guān)容器應(yīng)盡量潔凈、無菌、低溫條件保存；完成樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步試驗，短期可保存于-20℃，長期應(yīng)保存在-70℃。
4、操作臺、移液器、離心機、耗材等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實驗房間、超凈工作臺應(yīng)定期或每次實驗后用紫外燈處理。
5、所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存，-20℃保存的各種試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，使用后立即放回-20℃。
6、染色液有毒，應(yīng)于室溫下避光保存，操作時應(yīng)戴上手套，相應(yīng)操作結(jié)束后手套要處理掉，不能再接觸其它任何物品，以減少污染區(qū)。
7、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
8、實驗產(chǎn)生的廢棄物等應(yīng)及時收集，遠(yuǎn)離PCR實驗室才能進行無害化處理。
